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La enfermedad hemorrágica del CONEJO (RHD) es una forma aguda y letal de hepatitis viral en conejos ( Oryctolagus cuniculus ) con una tasa de mortalidad en adultos que oscila entre 70 y 100 por ciento. RHD fue reportado por primera vez en China en 1984, en Europa en 1986, donde causó severas pérdidas a conejo, y en Australia en 1996 ( Abrantes y otros 2012 ). El RHD es causado por el virus de la enfermedad del lagovirus (RHDV) en la familia Caliciviridae. En el transcurso de su evolución, el RHDV se dividió en seis genotipos ( Kerr y otros 2009 ), todos altamente patógenos y virulentos. El genotipo 6 es el subtipo antigénico (RHDVa) que se hizo prevalente en ciertos países, incluyendo los Estados Unidos ( McIntosh y otros 2007). Además, otros calicivirus entéricos no patógenos de conejo (RCVS) relacionados con RHDV se han identificado en Europa y Australia ( Capucci y otros 1996 , esforzarse y otros 2009 , Le Gall-Recule y otros 2011a ).
En 2010, se identificó un nuevo lavavirus en Francia. Este virus mostró una identidad de secuencia de la proteína de la cápside de aproximadamente el 80 por ciento con RHDV y fue capaz de causar RHD en conejos vacunados y jóvenes (15-25 días) ( Le Gall-Reculé y otros 2011a , b ). Además, mostró un perfil antigénico distinto e indujo una tasa de mortalidad media del 20-30% tanto en infecciones experimentales como en casos naturales; nunca se observó una tasa de mortalidad tan baja en las muchas infecciones experimentales de conejo realizadas con otras cepas de RHDV. El 70-80% restante de los conejos sobrevivió a la infección sin mostrar signos típicos de RHD ( Le Gall-Reculé y otros 2011b ). Inesperadamente, en otoño de 2011, este nuevo virus también causó casos mortales en liebres de capa (Lepus capensis var meditteraneus) ( Puggioni y otros, 2013 ). Todas estas características sugieren fuertemente que el virus no se derivó de RHDV, sino más bien que había surgido recientemente de una fuente desconocida; por esta razón, lo denominamos RHDV tipo 2 (RHDV2). Dentro de un par de años, el RHDV2 se extendió por toda Europa ( Le Gall-Reculé y otros 2013 , Dalton y otros 2014 ), donde causó brotes en granjas de conejos y en poblaciones silvestres. Con el tiempo, la tasa de mortalidad de los casos de RHDV2 en Italia pareció aumentar, al igual que la proporción de casos que resultaron en la ECR aguda.
Con el objetivo de establecer la patogenicidad (es decir, la proporción de conejos infectados que desarrollan RHD) de las cepas de campo recientes, se infectaron tres grupos, cada uno de los cuales consistía en cinco conejos adultos de Nueva Zelanda sanos, seronegativos. Cada conejo recibió, por vía oral, 1 ml de homogenado de hígado al 0,5% p / v de conejos que murieron de HRD agudo causado por las siguientes cepas: RHDVBs89 ( Capucci y otros 1996), que es la cepa RHDV de referencia, RHDV2Ta14 de un brote en la región de Puglia en 2014 y RHDV2Ch15 de un brote en la región de Abruzzo en 2015. Los ensayos se realizaron en un área designada para el Nivel 3 de bioseguridad. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Ministerio de Salud y se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos de las leyes nacionales (DM 4/3/2014 26) y europeas (2010/63 / EU) relativas al cuidado y uso de los animales.
Los tres aislamientos diferentes causaron síntomas similares de RHD y grados de patogenicidad (es decir, el 80 por ciento de los conejos desarrollaron un DAC agudo) ( Fig. 1 ).
Tiempo de muerte, expresado en horas postinfección, en los tres grupos experimentales (cinco conejos cada uno) debido al virus de la enfermedad hemorrágica de conejo tipo 2 (RHDV2) (caja gris claro completa) oa otras causas (cuadros discontinuos). AT, tiempo medio de supervivencia.
El tiempo promedio de morir después de la infección (pi) fue similar para RHDVBs89 y RHDV2Ta14, aproximadamente 70 horas, y ligeramente superior para RHDV2Ch15, 85 horas. RHDV y RHDV2 específicos ( OIE - Rabbit Haemorrhagic Disease 2012 ) realizados con homogeneizados hepáticos al 10% p / v, revelaron títulos virales (es decir, puntos finales de ELISA) que oscilaban entre 10 -2 y 10 -3, típico del RHD agudo. Durante los experimentos, también se registró la muerte de tres conejos, uno de cada grupo, sin signos de RHD. Durante la necropsia, encontramos enteritis relativamente grave con contenido fecal fluido, probablemente debido a una infección bacteriana; este resultado pudo haber sido una consecuencia del repentino cambio ambiental de la granja al área experimental. Los hígados de estos conejos eran negativos para RHDV basados en un ELISA pero positivos basados en RT-PCR, indicando que la infección estaba en curso. Desde 1990, hemos realizado varias infecciones experimentales de conejos con RHDV; los presentes experimentos fueron los primeros en que algunos conejos murieron a causa de otras causas que no fueran RHD. Aunque las muertes inusuales no fueron deseadas ni planeadas, nos permitieron observar un nuevo e interesante fenómeno. En los tres conejos que sufrían una infección bacteriana entérica severa, la replicación del RHDV altamente patógeno se inhibió fuertemente hasta al menos 96 horas pi, momento en el que todos los demás conejos infectados habían muerto ya de RHD. Tal "resistencia" adquirida a la RHD en estos tres conejos podría deberse a la rápida activación y acción del sistema inmune innato estimulado por la infección bacteriana, lo que indirectamente limitó la replicación del RHDV. Los estudios sobre la inmunidad innata en conejos jóvenes han sugerido previamente la implicación directa del sistema inmune innato en la resistencia y la susceptibilidad al RHD ( Tal "resistencia" adquirida a la RHD en estos tres conejos podría deberse a la rápida activación y acción del sistema inmune innato estimulado por la infección bacteriana, lo que indirectamente limitó la replicación del RHDV. Los estudios sobre la inmunidad innata en conejos jóvenes han sugerido previamente la implicación directa del sistema inmune innato en la resistencia y la susceptibilidad al RHD ( Tal "resistencia" adquirida a la RHD en estos tres conejos podría deberse a la rápida activación y acción del sistema inmune innato estimulado por la infección bacteriana, lo que indirectamente limitó la replicación del RHDV. Los estudios sobre la inmunidad innata en conejos jóvenes han sugerido previamente la implicación directa del sistema inmune innato en la resistencia y la susceptibilidad al RHD (Marques y otros 2014 ).
Este ensayo de virulencia, el primero descrito hasta ahora para utilizar cepas de RHDV2 identificadas después de 2011, mostró que las dos cepas italianas de RHDV2 aisladas en 2014 y 2015 indujeron al menos un 80% de mortalidad, que se aproxima a la tasa de mortalidad habitual del RHDV y es cuatro veces mayor que la encontrada en los primeros aislamientos de RHDV2 ( Le Gall-Reculé y otros 2013 ). Teniendo en cuenta que recientemente observamos varios brotes naturales de RHDV2 en conejos de cría caracterizados por mayores tasas de mortalidad, concluimos que las cepas de RHDV2 altamente patógenas han surgido durante la evolución del virus y se han vuelto frecuentes en el campo.
El aumento significativo demostrado en la patogenicidad del RHDV2 dentro de unos pocos años apoya dos hipótesis. El primero ya se ha expuesto para explicar la evolución del RHDV en conejos silvestres en Australia ( Elsworth y otros, 2014 ): alta patogenicidad y virulencia en RHDV son rasgos que se someten a selección positiva. Presumiblemente, permiten la propagación rápida del RHDV y la presencia sostenida en las poblaciones de huéspedes de conejo. La segunda hipótesis se relaciona con el origen del RHDV2 y su estado como un virus recién emergente y no como una variante directa de los anteriores RHDV ( Le Gall-Reculé y otros 2013). De hecho, nuestros resultados indican que los primeros aislamientos de RHDV2 de 2010 a 2011 son, entre los conocidos RHDV, los únicos ligeramente patógenos. Así, a este respecto, se asemejan al calicivirus de conejo de Michigan (MRCV), identificado en 2001 en una granja de conejos de EE.UU., que se asoció con episodios de enfermedad tipo RHD y tenía una tasa total de letalidad de aproximadamente 30% ( Bergin y otros 2009 ). Debido a que el genoma de MRCV es único entre los lavavirus y no se reportaron brotes posteriores ni se identificó de nuevo, MRCV podría ser considerado como un "intento" de emergencia por un nuevo virus tipo RHDV. La razón de la transmisión y el «éxito» evolutivo de RHDV2, en comparación con el «fracaso» de MRCV, podría ser la fuerte presencia en Europa de huéspedes susceptibles ( Oryctolagus cuniculus) en la naturaleza y en las granjas; esto puede haber permitido RHDV2 completar su transición a un virus altamente patógeno. Por el contrario, en los EE. UU., Los conejos europeos están presentes sólo en unas pocas fincas y no hay poblaciones silvestres, situación que no es suficiente para apoyar la difusión y persistencia de un lavavirus. Esto también se demuestra por el hecho de que el RHDVa patógeno no es endémico en los EE.UU. a pesar de la ocurrencia de algunos brotes.
A la luz de estos resultados y del hecho de que las diferencias inmunogénicas entre RHDV y RHDV2 ocurren en el nivel de serotipo, existe una necesidad urgente de vacunas homólogas de RHDV2 que puedan proteger completamente a los conejos de RHD y limitar la contaminación ambiental y la difusión de RHDV2 en países afectados . RHDV2 ha estado presente desde 2011 en varios países europeos, pero, como sugiere este estudio, está evolucionando rápidamente, y es probable que la distribución de variantes antigénicas (subtipos) cambie. Por lo tanto, la elección específica del aislado RHDV2 será importante en la producción de vacunas específicas.
Por último, si bien el RHDV2 ha sido el virus dominante que ha causado la enfermedad cardíaca en la mayoría de los países europeos en los últimos años, el hecho de que la RHDVa siga coexistiendo en algunas zonas (Italia) hace aconsejable vacunar a los animales contra RHDV2 y las cepas RHDV / .
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a Giuliana Botti, Alessandra Previdi y Dante Pedretti por su cuidadoso apoyo técnico. Los autores agradecen a Jennie S. Lavine (ScienceDocs) por editar este manuscrito.
- Aceptado el 16 de febrero de 2017.